近期，翌圣鎂孚泰基于天木生物高通量皮升級液滴單細胞分選系統(tǒng)（DREM cell）設備，在《The FEBS Journal》期刊上發(fā)表題為Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities的研究論文。該研究使用DREM cell高通量細胞分選儀，結合酶的定向進化技術，對T7 RNAP進行了成功改造，改造后的T7 RNAP在轉(zhuǎn)錄過程中能夠直接大幅減少dsRNA的生成（僅為野生型的1.8%），同時顯著提升了合成mRNA的整體效率和質(zhì)量。這一突破性進展有望為基因治療和疫苗開發(fā)領域帶來革命性的變化，推動相關技術的進一步發(fā)展。
研究背景
雙鏈RNA（dsRNA）是體外轉(zhuǎn)錄（IVT）過程中常見的副產(chǎn)物，可激活宿主細胞的免疫反應（如通過PKR和OAS通路抑制翻譯），影響mRNA藥物的安全性和有效性。T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）是IVT的核心工具，但其末端轉(zhuǎn)移酶活性和RNA依賴性RNA聚合酶（RDRP）活性會導致dsRNA生成。傳統(tǒng)方法依賴純化去除dsRNA，但本研究提出通過改造T7 RNAP本身減少dsRNA的產(chǎn)生，以提高mRNA產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。
方法與技術平臺
1、高通量篩選技術（FADS）
原理：基于DREM cell設備液滴微流控方法生成液滴，液滴內(nèi)包含裂解試劑、熒光底物和過表達目標酶突變體的大腸桿菌細胞，孵育過程進行細胞的裂解和RNA轉(zhuǎn)錄，隨后將液滴導入分選芯片進行熒光檢測和分選。
優(yōu)勢：超高通量（每日篩選106-108液滴）、低試劑消耗（皮升級反應體積）。
流程：構建隨機突變庫→液滴內(nèi)轉(zhuǎn)錄→熒光檢測→分選高熒光液滴（對應低dsRNA突變體）
（液滴生成與分選）
2、分子信標與雙探針檢測
分子信標：結合RNA 3'端，熒光強度與互補區(qū)長度正相關，用于區(qū)分完整RNA和dsRNA。
雙探針系統(tǒng)：5'端Cy5探針檢測RNA產(chǎn)量，3'端FAM探針檢測dsRNA含量，通過熒光比值篩選高產(chǎn)低副產(chǎn)物突變體。
3、半理性設計與結構分析
靶點選擇：結合分子動力學模擬（GROMACS）和FoldX/PROSS軟件，針對T7 RNAP構象轉(zhuǎn)換關鍵區(qū)域（如螺旋C、H亞結構域）進行定點飽和突變。
關鍵突變位點：A70Q（穩(wěn)定延伸構象）、F162S/A247T（降低RDRP活性）、K180E（減少模板結合偏向性）。
4、功能驗證實驗
dsRNA檢測：J2抗體免疫印跡、ELISA定量。
免疫原性評估：轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞檢測IFN-β表達，HEK293細胞評估EGFP翻譯效率。
酶活性分析：通過發(fā)夾結構底物檢測RDRP活性，NGS分析RNA 3'端異質(zhì)性評估末端轉(zhuǎn)移酶活性。
1. 突變體篩選與性能
使用DREM cell生成兩個百萬級液滴文庫（Lib3，Lib5），經(jīng)過兩輪分選成功篩選出關鍵候選突變體
單點突變體：M1（V214A）、M7（F162S/A247T）、M11（K180E）、M14（A70Q）顯著降低dsRNA生成（達野生型的3-7%）。
組合突變體：M17（A70Q/F162S/K180E），表現(xiàn)最優(yōu)，dsRNA含量僅為野生型的1.8%，在篩選體系中僅為0.007 ng/μg。
這一結果不僅在體外實驗中得到了驗證，還在細胞實驗中表現(xiàn)出顯著的免疫原性降低和蛋白翻譯效率提升。我們將突變體轉(zhuǎn)錄的mRNA導入RAW264.7細胞后，最優(yōu)突變體M11產(chǎn)物引發(fā)的干擾素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表達量僅為野生型的9.7%和12.93 pg/mL。在HEK293細胞中，突變體mRNA的EGFP表達細胞數(shù)顯著增加，且熒光強度穩(wěn)定。這表明，減少dsRNA可有效解除PKR介導的翻譯抑制，釋放mRNA治療潛力。
2. 機制解析
末端轉(zhuǎn)移酶活性：野生型T7 RNAP傾向于在RNA 3'端添加額外核苷酸（如胞嘧啶），促進互補配對；突變體（如M17）該活性降低50%以上。
RDRP活性：突變體對RNA模板的結合能力減弱，減少了以RNA為模板的互補鏈合成。
構象穩(wěn)定性：突變（如A70Q）通過穩(wěn)定延伸構象，減少流產(chǎn)RNA生成，從而間接抑制dsRNA形成。
為了深入了解突變體降低dsRNA的作用機制，我們通過計算機模擬與功能實驗，揭示了突變體是由于降低了RNA依賴的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端轉(zhuǎn)移酶活性而導致dsRNA的降低，這一發(fā)現(xiàn)為未來進一步優(yōu)化 T7 RNAP提供了重要的理論依據(jù)。
3. 應用潛力
突變體mRNA的免疫原性顯著降低（IFN-β表達下降90%），且翻譯效率提高（EGFP陽性細胞數(shù)增加）。
為mRNA疫苗/藥物的生產(chǎn)提供了更安全、高效的T7 RNAP工具。
1. 隨機突變庫+DREM cell：構建基于分子信標熒光探針的高通量分選系統(tǒng)，采用DREM cell累計篩選超過107個液滴，篩選效率大幅提升。
2. 微液滴反應體系：液滴內(nèi)進行細胞裂解、轉(zhuǎn)錄反應及熒光探針結合過程，精準捕捉低產(chǎn)dsRNA突變體，試劑消耗降低百倍。
3. 酶工程突破：T7 RNAP組合突變M17（A70Q/F162S/K180E），dsRNA含量降至野生型的1.8%。
4. 細胞實驗驗證：M17突變體顯著降低免疫因子IFN-β表達，提升EGFP蛋白翻譯效率。
5. 機制揭秘：末端轉(zhuǎn)移酶活性是“元兇”，突變體通過降低末端轉(zhuǎn)移酶和RNA依賴的RNA聚合酶（RDRP）活性，減少3'端非模板核苷酸添加，阻斷dsRNA互補配對。
關于DREM cell 高通量液滴微流控細胞分選儀
DREM cell 是一款集合液滴生成、液滴分選、液滴微注入及液滴打印的多功能、高通量、全自動設備。其結合液滴微流控技術和介電泳分選技術，由多光路熒光檢測系統(tǒng)、高速顯微成像系統(tǒng)、自動對焦載物臺、微全分析系統(tǒng)、介電泳分選系統(tǒng)、圖像監(jiān)控系統(tǒng)和強大的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。可用于檢測、分選、挑取和分離單細胞、細胞團、球體、類器等，為疾病檢測、個性化治療、疫苗研發(fā)、單克隆抗體制備以及生物制品制造等領域研究提供了準確、高效、便捷、經(jīng)濟的自動化工具。
近期，翌圣鎂孚泰基于天木生物高通量皮升級液滴單細胞分選系統(tǒng)（DREM cell）設備，在《The FEBS Journal》期刊上發(fā)表題為Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities的研究論文。該研究使用DREM cell高通量細胞分選儀，結合酶的定向進化技術，對T7 RNAP進行了成功改造，改造后的T7 RNAP在轉(zhuǎn)錄過程中能夠直接大幅減少dsRNA的生成（僅為野生型的1.8%），同時顯著提升了合成mRNA的整體效率和質(zhì)量。這一突破性進展有望為基因治療和疫苗開發(fā)領域帶來革命性的變化，推動相關技術的進一步發(fā)展。
研究背景
雙鏈RNA（dsRNA）是體外轉(zhuǎn)錄（IVT）過程中常見的副產(chǎn)物，可激活宿主細胞的免疫反應（如通過PKR和OAS通路抑制翻譯），影響mRNA藥物的安全性和有效性。T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）是IVT的核心工具，但其末端轉(zhuǎn)移酶活性和RNA依賴性RNA聚合酶（RDRP）活性會導致dsRNA生成。傳統(tǒng)方法依賴純化去除dsRNA，但本研究提出通過改造T7 RNAP本身減少dsRNA的產(chǎn)生，以提高mRNA產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。
方法與技術平臺
1、高通量篩選技術（FADS）
原理：基于DREM cell設備液滴微流控方法生成液滴，液滴內(nèi)包含裂解試劑、熒光底物和過表達目標酶突變體的大腸桿菌細胞，孵育過程進行細胞的裂解和RNA轉(zhuǎn)錄，隨后將液滴導入分選芯片進行熒光檢測和分選。
優(yōu)勢：超高通量（每日篩選106-108液滴）、低試劑消耗（皮升級反應體積）。
流程：構建隨機突變庫→液滴內(nèi)轉(zhuǎn)錄→熒光檢測→分選高熒光液滴（對應低dsRNA突變體）
（液滴生成與分選）
2、分子信標與雙探針檢測
分子信標：結合RNA 3'端，熒光強度與互補區(qū)長度正相關，用于區(qū)分完整RNA和dsRNA。
雙探針系統(tǒng)：5'端Cy5探針檢測RNA產(chǎn)量，3'端FAM探針檢測dsRNA含量，通過熒光比值篩選高產(chǎn)低副產(chǎn)物突變體。
3、半理性設計與結構分析
靶點選擇：結合分子動力學模擬（GROMACS）和FoldX/PROSS軟件，針對T7 RNAP構象轉(zhuǎn)換關鍵區(qū)域（如螺旋C、H亞結構域）進行定點飽和突變。
關鍵突變位點：A70Q（穩(wěn)定延伸構象）、F162S/A247T（降低RDRP活性）、K180E（減少模板結合偏向性）。
4、功能驗證實驗
dsRNA檢測：J2抗體免疫印跡、ELISA定量。
免疫原性評估：轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞檢測IFN-β表達，HEK293細胞評估EGFP翻譯效率。
酶活性分析：通過發(fā)夾結構底物檢測RDRP活性，NGS分析RNA 3'端異質(zhì)性評估末端轉(zhuǎn)移酶活性。
1. 突變體篩選與性能
使用DREM cell生成兩個百萬級液滴文庫（Lib3，Lib5），經(jīng)過兩輪分選成功篩選出關鍵候選突變體
單點突變體：M1（V214A）、M7（F162S/A247T）、M11（K180E）、M14（A70Q）顯著降低dsRNA生成（達野生型的3-7%）。
組合突變體：M17（A70Q/F162S/K180E），表現(xiàn)最優(yōu)，dsRNA含量僅為野生型的1.8%，在篩選體系中僅為0.007 ng/μg。
這一結果不僅在體外實驗中得到了驗證，還在細胞實驗中表現(xiàn)出顯著的免疫原性降低和蛋白翻譯效率提升。我們將突變體轉(zhuǎn)錄的mRNA導入RAW264.7細胞后，最優(yōu)突變體M11產(chǎn)物引發(fā)的干擾素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表達量僅為野生型的9.7%和12.93 pg/mL。在HEK293細胞中，突變體mRNA的EGFP表達細胞數(shù)顯著增加，且熒光強度穩(wěn)定。這表明，減少dsRNA可有效解除PKR介導的翻譯抑制，釋放mRNA治療潛力。
2. 機制解析
末端轉(zhuǎn)移酶活性：野生型T7 RNAP傾向于在RNA 3'端添加額外核苷酸（如胞嘧啶），促進互補配對；突變體（如M17）該活性降低50%以上。
RDRP活性：突變體對RNA模板的結合能力減弱，減少了以RNA為模板的互補鏈合成。
構象穩(wěn)定性：突變（如A70Q）通過穩(wěn)定延伸構象，減少流產(chǎn)RNA生成，從而間接抑制dsRNA形成。
為了深入了解突變體降低dsRNA的作用機制，我們通過計算機模擬與功能實驗，揭示了突變體是由于降低了RNA依賴的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端轉(zhuǎn)移酶活性而導致dsRNA的降低，這一發(fā)現(xiàn)為未來進一步優(yōu)化 T7 RNAP提供了重要的理論依據(jù)。
3. 應用潛力
突變體mRNA的免疫原性顯著降低（IFN-β表達下降90%），且翻譯效率提高（EGFP陽性細胞數(shù)增加）。
為mRNA疫苗/藥物的生產(chǎn)提供了更安全、高效的T7 RNAP工具。
1. 隨機突變庫+DREM cell：構建基于分子信標熒光探針的高通量分選系統(tǒng)，采用DREM cell累計篩選超過107個液滴，篩選效率大幅提升。
2. 微液滴反應體系：液滴內(nèi)進行細胞裂解、轉(zhuǎn)錄反應及熒光探針結合過程，精準捕捉低產(chǎn)dsRNA突變體，試劑消耗降低百倍。
3. 酶工程突破：T7 RNAP組合突變M17（A70Q/F162S/K180E），dsRNA含量降至野生型的1.8%。
4. 細胞實驗驗證：M17突變體顯著降低免疫因子IFN-β表達，提升EGFP蛋白翻譯效率。
5. 機制揭秘：末端轉(zhuǎn)移酶活性是“元兇”，突變體通過降低末端轉(zhuǎn)移酶和RNA依賴的RNA聚合酶（RDRP）活性，減少3'端非模板核苷酸添加，阻斷dsRNA互補配對。
關于DREM cell 高通量液滴微流控細胞分選儀
DREM cell 是一款集合液滴生成、液滴分選、液滴微注入及液滴打印的多功能、高通量、全自動設備。其結合液滴微流控技術和介電泳分選技術，由多光路熒光檢測系統(tǒng)、高速顯微成像系統(tǒng)、自動對焦載物臺、微全分析系統(tǒng)、介電泳分選系統(tǒng)、圖像監(jiān)控系統(tǒng)和強大的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。可用于檢測、分選、挑取和分離單細胞、細胞團、球體、類器等，為疾病檢測、個性化治療、疫苗研發(fā)、單克隆抗體制備以及生物制品制造等領域研究提供了準確、高效、便捷、經(jīng)濟的自動化工具。
