本期為您推薦天津科技大學生物工程學院路福平教授、秦慧民教授團隊在《Biosensors and Bioelectronics》發(fā)表重要研究成果：Programming a bacterial biosensor for directed evolution of tryptophan hydroxylase via high-throughput droplet sorting。
本研究基于細菌生物傳感器，結合高通量液滴分選平臺實現(xiàn)了色氨酸羥化酶的定向進化，成功獲得了催化活性比親本高4.25倍的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
關于色氨酸羥化酶
5-羥色胺（5-HydroxyTryptamine，5-HT）是一種抑制性神經(jīng)遞質，又名血清素（serotonin），是讓我們大腦感到“快樂”的激素，能抑制憂郁、促進褪黑素合成、改善睡眠質量等，對于睡眠與消化都起到至關重要的作用，在治療疾病等領域有廣泛應用。5-HT是色氨酸代謝過程中的中間體，由色氨酸羥化酶（TPH）催化產(chǎn)生。由于TPH天然酶活性不足、穩(wěn)定性差，限制了工業(yè)生產(chǎn)過程，更有效的TPH變體的開發(fā)便引起了科學和工業(yè)界的極大關注。
定向進化方法與技術平臺
基于液滴微流控技術，作者構建了色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺（DTSP），旨在改善TPH的應用性能。作者設計了一種用于檢測L-色氨酸（L-Trp）的細菌生物傳感器，該傳感器將L-Trp濃度與熒光信號之間聯(lián)系起來，基于熒光信號檢測，結合迭代飽和誘變策略，成功獲得了熱穩(wěn)定性提高（45℃條件下的半衰期延長3.2倍），催化活性提高（比親本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺（DTSP）
1. 色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺（DTSP）的設計與構建
DTPS平臺的設計及構建主要分為三個主要步驟（圖1）
① 構建TPH突變文庫，然后使用液滴生成裝置將突變后的產(chǎn)酶菌（Enzyme-producing bacteria，EPB）包裹形成含單細胞的液滴，孵育一段時間后，EPB在液滴中進行細胞增殖和L-Trp的生物轉化過程；
② 將基因改造后的檢測細菌（Detection bacteria，DB）預培養(yǎng)一段時間后，注射入液滴內再次孵育；
③ 通過檢測液滴中剩余的L-Trp產(chǎn)生熒光信號來測定酶的工作效率，并分離陽性突變體以進行進一步驗證。
圖1 色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺（DTSP）構建流程
2. 液滴微流控平臺工作流程
DTSP平臺由三部分組成：液滴生成、液滴微注入和液滴分選。為了保證液滴的單細胞包裹率，根據(jù)泊松分布（μ=0.1）生成包裹單個細胞的液滴，37℃孵育12小時后，根據(jù)熒光信號分選獲得目標液滴，在培養(yǎng)和分選過程中液滴形態(tài)完整，細菌生長狀態(tài)良好。
控篩選平臺（DTSP），旨在改善TPH的應用性能。作者設計了一種用于檢測L-色氨酸（L-Trp）的細菌生物傳感器，該傳感器將L-Trp濃度與熒光信號之間聯(lián)系起來，基于熒光信號檢測，結合迭代飽和誘變策略，成功獲得了熱穩(wěn)定性提高（45℃條件下的半衰期延長3.2倍），催化活性提高（比親本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
圖2 液滴微流控平臺工作流程
3. 基于DTSP的CviPAH突變文庫的篩選
使用epPCR構建CviPAH突變文庫，經(jīng)過兩輪活性和熱穩(wěn)定性篩選后，得到了8個優(yōu)勢突變體，酶活性增加了30-113%，且均表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性，在45℃下熱處理1小時后剩余活性為39.5-53.7%，顯著好于野生型CviPAH。結合迭代飽和誘變（ISM）和液滴微流控平臺（DTSP）進一步篩選獲得突變體M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K），其酶活性比野生型CviPAH增高了4.25倍，催化效率提高了13.9倍，熱穩(wěn)定性提高了3.2倍。
圖3 基于DTSP的CviPAH突變文庫的篩選
總結
細菌生物傳感器與基于液滴的微流控篩選平臺（DTSP）相結合，在篩選工業(yè)用酶等領域具有顯著優(yōu)勢。并且，使用兩個獨立菌株分別進行酶生產(chǎn)和檢測，有助于提高篩選過程的準確性和效率。該研究為酶類的篩選提供了一個強有力的工具，并為篩選工業(yè)酶建立了一個高效的方案。
天木生物孵化于清華大學無錫應用技術研究院，深耕于液滴微流控領域多年，具有成熟的研發(fā)團隊，將液滴微流控技術與微管式反應器技術完美結合，其自主研發(fā)單細胞高通量分選設備（DREM cell及MISS cell），全自動化完成液滴生成、液滴培養(yǎng)和液滴檢測及篩選的全工作流程，廣泛應用于醫(yī)藥研發(fā)、酶的篩選及進化、合成生物學等多領域。設備自動化程度高，操作簡單，大幅提高篩選效率，為醫(yī)藥、工業(yè)及科學研發(fā)提供強有力的高精尖設備和技術支持。
本期為您推薦天津科技大學生物工程學院路福平教授、秦慧民教授團隊在《Biosensors and Bioelectronics》發(fā)表重要研究成果：Programming a bacterial biosensor for directed evolution of tryptophan hydroxylase via high-throughput droplet sorting。
本研究基于細菌生物傳感器，結合高通量液滴分選平臺實現(xiàn)了色氨酸羥化酶的定向進化，成功獲得了催化活性比親本高4.25倍的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
關于色氨酸羥化酶
5-羥色胺（5-HydroxyTryptamine，5-HT）是一種抑制性神經(jīng)遞質，又名血清素（serotonin），是讓我們大腦感到“快樂”的激素，能抑制憂郁、促進褪黑素合成、改善睡眠質量等，對于睡眠與消化都起到至關重要的作用，在治療疾病等領域有廣泛應用。5-HT是色氨酸代謝過程中的中間體，由色氨酸羥化酶（TPH）催化產(chǎn)生。由于TPH天然酶活性不足、穩(wěn)定性差，限制了工業(yè)生產(chǎn)過程，更有效的TPH變體的開發(fā)便引起了科學和工業(yè)界的極大關注。
定向進化方法與技術平臺
基于液滴微流控技術，作者構建了色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺（DTSP），旨在改善TPH的應用性能。作者設計了一種用于檢測L-色氨酸（L-Trp）的細菌生物傳感器，該傳感器將L-Trp濃度與熒光信號之間聯(lián)系起來，基于熒光信號檢測，結合迭代飽和誘變策略，成功獲得了熱穩(wěn)定性提高（45℃條件下的半衰期延長3.2倍），催化活性提高（比親本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺（DTSP）
1. 色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺（DTSP）的設計與構建
DTPS平臺的設計及構建主要分為三個主要步驟（圖1）
① 構建TPH突變文庫，然后使用液滴生成裝置將突變后的產(chǎn)酶菌（Enzyme-producing bacteria，EPB）包裹形成含單細胞的液滴，孵育一段時間后，EPB在液滴中進行細胞增殖和L-Trp的生物轉化過程；
② 將基因改造后的檢測細菌（Detection bacteria，DB）預培養(yǎng)一段時間后，注射入液滴內再次孵育；
③ 通過檢測液滴中剩余的L-Trp產(chǎn)生熒光信號來測定酶的工作效率，并分離陽性突變體以進行進一步驗證。
圖1 色氨酸羥化酶超高通量微流控篩選平臺（DTSP）構建流程
2. 液滴微流控平臺工作流程
DTSP平臺由三部分組成：液滴生成、液滴微注入和液滴分選。為了保證液滴的單細胞包裹率，根據(jù)泊松分布（μ=0.1）生成包裹單個細胞的液滴，37℃孵育12小時后，根據(jù)熒光信號分選獲得目標液滴，在培養(yǎng)和分選過程中液滴形態(tài)完整，細菌生長狀態(tài)良好。
控篩選平臺（DTSP），旨在改善TPH的應用性能。作者設計了一種用于檢測L-色氨酸（L-Trp）的細菌生物傳感器，該傳感器將L-Trp濃度與熒光信號之間聯(lián)系起來，基于熒光信號檢測，結合迭代飽和誘變策略，成功獲得了熱穩(wěn)定性提高（45℃條件下的半衰期延長3.2倍），催化活性提高（比親本高4.25倍）的M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K）突變體。
圖2 液滴微流控平臺工作流程
3. 基于DTSP的CviPAH突變文庫的篩選
使用epPCR構建CviPAH突變文庫，經(jīng)過兩輪活性和熱穩(wěn)定性篩選后，得到了8個優(yōu)勢突變體，酶活性增加了30-113%，且均表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性，在45℃下熱處理1小時后剩余活性為39.5-53.7%，顯著好于野生型CviPAH。結合迭代飽和誘變（ISM）和液滴微流控平臺（DTSP）進一步篩選獲得突變體M4-1（D129L/Q132M/P103A/T236K），其酶活性比野生型CviPAH增高了4.25倍，催化效率提高了13.9倍，熱穩(wěn)定性提高了3.2倍。
圖3 基于DTSP的CviPAH突變文庫的篩選
總結
細菌生物傳感器與基于液滴的微流控篩選平臺（DTSP）相結合，在篩選工業(yè)用酶等領域具有顯著優(yōu)勢。并且，使用兩個獨立菌株分別進行酶生產(chǎn)和檢測，有助于提高篩選過程的準確性和效率。該研究為酶類的篩選提供了一個強有力的工具，并為篩選工業(yè)酶建立了一個高效的方案。
天木生物孵化于清華大學無錫應用技術研究院，深耕于液滴微流控領域多年，具有成熟的研發(fā)團隊，將液滴微流控技術與微管式反應器技術完美結合，其自主研發(fā)單細胞高通量分選設備（DREM cell及MISS cell），全自動化完成液滴生成、液滴培養(yǎng)和液滴檢測及篩選的全工作流程，廣泛應用于醫(yī)藥研發(fā)、酶的篩選及進化、合成生物學等多領域。設備自動化程度高，操作簡單，大幅提高篩選效率，為醫(yī)藥、工業(yè)及科學研發(fā)提供強有力的高精尖設備和技術支持。
