本期為您推薦貴州大學生命科學院李祝教授課題組在基于微流控技術的高通量篩選方面相關的工作。該課題組通過液滴微流控平臺篩選拮抗菌，與傳統的瓊脂平板篩選方法相比，篩選效率提高了約3000倍。篩選得到的突變體，其抑菌活性較野生型菌株提高了62%。

圖1 拮抗菌的高通量篩選流程

       軟腐病是一種嚴重影響農作物的細菌性植物病害，主要由軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）引起，發生在蔬菜和觀賞植物的肉質儲存組織中。這種病害可以迅速在植物體內擴散，造成組織水解、腐爛，最終導致作物減產甚至全軍覆沒，從而給農業生產帶來巨大的經濟損失，并成為限制農業可持續發展的重要因素之一。

       隨著現代生物技術的快速發展，生物防治因具有生物防治效果好，無毒無害，無污染等特點越來越來受到人們的重視。農用抗生素（生物活性物質）、拮抗微生物等在病蟲害防治研究中得到了較好的應用。傳統的拮抗菌篩選通常采用瓊脂平板法進行的分離和篩選，具有高勞動強度、高成本和低效率的限制因素，顯著影響拮抗菌的篩選和應用。隨著液滴微流控技術的發展，利用其高通量的特性構建新的篩選平臺—DREM Cell，顯著提高篩選效率的同時大幅降低了成本。

       研究人員采集來自貴州省畢節市某魔芋種植區表面10 cm下的土壤樣本，分別采用液滴體系與培養皿體系進行微生物資源探查。鏡檢結果顯示含菌液滴數量約占總液滴數量的12.22%，液滴中菌落數與平板數量基本一致，表明菌株在液滴中的生長與平板培養具有相當水平（圖2）。對不同培養條件下得到的菌落進行分析發現，液滴培養樣品中95%以上的OTU屬于稀有生物圈，其相對豐度在原始土壤樣品中低于0.01%（圖3），這表明液滴培養在揭示復雜微生物群落中罕見生物圈方面具有巨大潛力。

圖2 液滴生成和培養液滴樣品的顯微鏡圖像

圖3 不同培養樣品的擴增子測序結果比較

       利用GFP-Ecc15菌株作為報告菌，拮抗菌可以抑制報告菌株的生長，從而顯著降低體系的熒光值（圖4，5）。在拮抗菌B. velezensis 和非拮抗菌E. coli 混合體系的富集篩選中驗證了篩選體系的適用性，建立拮抗菌的高通量篩選模型。拮抗菌的最大富集效率達到226倍，三次重復實驗拮抗菌的平均富集效率提高148倍。結果說明，基于液滴微流控的篩選模型能夠很好地將對報告菌株具有抑制作用的細菌分離出來。

圖4 GFP-Ecc15在液滴中的生長情況

圖5 拮抗菌與非拮抗菌對GFP-Ecc15熒光值的影響

       最后基于該高通量模型，對土壤環境復雜樣本進行拮抗菌株的篩選。以每小時105個細胞速率進行分選，分選后的液滴涂布至平板，選取單菌落通過瓊脂擴散法驗證其對病原指示菌Ecc15的抑菌能力。經過篩選，32株具有抗菌活性的細菌被富集，其中最佳菌株的抑菌直徑達到20.86±1.56 mm。經過ARTP誘變，抑菌直徑進一步擴大至26.15±0.29 mm，顯著大于出發菌株的18.31±0.64 mm（圖6），抑菌活性提升62%。

圖6 高活性突變體與野生型抑菌圈差異

       本研究將液滴微流控技術與ARTP誘變結合，利用DREM Cell平臺開展高通量拮抗菌篩選工作，進行環境微生物資源挖掘、復雜樣本拮抗菌株篩選以及菌株突變庫篩選工作。相較于傳統方法，培養基的試劑消耗降低至1.2×107分之一，篩選速率提升3000多倍，成功從土壤樣品中篩選并誘變得到高效的拮抗菌。該平臺為拮抗菌的篩選提供了一種更高效和成本更低的解決方案，為農業生物防治提供了一個全新的視角，對于深入理解和利用隱藏于微小土壤顆粒中的生物資源有重要意義。

論文DOI：10.27047/d.cnki.ggudu.2023.001995