本期為您推薦天津科技大學(xué)路福平教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在《Bioresource Technology》上的一篇文章：Multidimensional combinatorial screening for high-level production of erythritol in Yarrowia lipolytica。
作者采用了一種多維度組合篩選策略，包括基于生長(zhǎng)耦合生物傳感器的適應(yīng)性進(jìn)化篩選平臺(tái)（EVOL cell）以及代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)快速篩選能夠高效利用粗甘油生產(chǎn)赤蘚糖醇的突變菌株，為生物基產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了新的思路和方法。
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作為一種被廣泛研究的宿主菌株，工程化改造后能夠?qū)⑸锊裼托袠I(yè)的副產(chǎn)品粗甘油酯轉(zhuǎn)化為赤蘚糖醇，實(shí)現(xiàn)其高值化利用，但其生產(chǎn)效率有待提高。因此，需對(duì)解脂耶氏酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重構(gòu)，以實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化應(yīng)用。
然而，對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜調(diào)控細(xì)節(jié)的了解不足仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。研究者認(rèn)為需通過(guò)多維組合篩選不斷挖掘非直觀的目標(biāo)基因，而隨機(jī)誘變和適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化是提高宿主菌株代謝性能的有效方法，因此研究者構(gòu)建了一套包括生長(zhǎng)偶聯(lián)的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化和代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)在內(nèi)的多維組合篩選策略。
本研究利用基于Eryd轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和其DNA結(jié)合序列的生物傳感器，構(gòu)建了響應(yīng)赤蘚糖醇的熒光偶聯(lián)生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了解脂耶氏酵母中赤蘚糖醇水平的動(dòng)態(tài)檢測(cè)。
圖1 赤蘚糖醇生物傳感器的構(gòu)建和優(yōu)化
隨后將 LEU2 基因替代 DsRed 基因，以細(xì)胞生長(zhǎng)表型作為輸出信號(hào)，構(gòu)建了生長(zhǎng)偶聯(lián)的生物傳感器。利用ARTP誘變育種儀對(duì)含有生長(zhǎng)偶聯(lián)生物傳感器的解脂耶氏酵母進(jìn)行誘變，并通過(guò)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)菌株生長(zhǎng)條件的EVOL cell自動(dòng)連續(xù)培養(yǎng)篩選突變體，完成全自動(dòng)適應(yīng)性進(jìn)化。
EVOL cell是基于高氣體透過(guò)性微管路及單相微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)而成的微生物馴化裝備，具有環(huán)境氧分壓調(diào)控、溫度控制、化學(xué)因子梯度添加等多種適應(yīng)性進(jìn)化策略，可滿足不同實(shí)驗(yàn)需求，靈活調(diào)整壓力條件，全自動(dòng)進(jìn)行單因素或多因素實(shí)驗(yàn)。
突變株在EVOL cell中進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)48天的連續(xù)監(jiān)測(cè)和自動(dòng)連續(xù)培養(yǎng)，全程無(wú)需人工值守。經(jīng)過(guò)5個(gè)適應(yīng)階段的富集（篩選介質(zhì)中亮氨酸濃度從100 mM逐漸降低到0 mM），最終篩選出了14個(gè)具有大型菌落的突變菌株G02-15。在250 mL搖瓶發(fā)酵中評(píng)估這些突變菌株的赤蘚糖醇生產(chǎn)性能，結(jié)果顯示，G12菌株赤蘚糖醇滴度最高（62.4 g/L），是對(duì)照菌株G01的4.4倍。
隨后對(duì)G12進(jìn)行基因組測(cè)序及反向工程，發(fā)現(xiàn)SMF1、NADPH脫氫酶和ER1 D46A（M1）突變對(duì)赤蘚糖醇合成有積極影響。
圖2 開(kāi)發(fā)基于生長(zhǎng)偶聯(lián)生物傳感器和 EVOL cell篩選平臺(tái)
隨后進(jìn)一步對(duì)赤蘚糖醇生物合成的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重構(gòu)。先對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行分子修飾，通過(guò)迭代組合突變法，提高赤蘚糖醇還原酶 ER1 的催化活性。隨后敲除分解赤蘚糖醇的基因，過(guò)表達(dá)與甘油同化及前體供應(yīng)相關(guān)的基因，進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)。最終得到的菌株G31赤蘚糖醇滴度顯著提升了83.5 g/L。
圖3 ER基因的分子改造
圖4 工程菌株赤蘚糖醇生產(chǎn)性能的評(píng)價(jià)
最后于5L生物反應(yīng)器中，G31菌株的細(xì)胞密度和廢棄甘油消耗、赤蘚糖醇滴度、生產(chǎn)率和產(chǎn)率均高于G01菌株。其中G31菌株的赤蘚糖醇滴度達(dá)到了220.5 g/L，生產(chǎn)率為1.8 g/L/h，產(chǎn)率為0.6 g/g廢棄甘油。
本研究為基于生物傳感器的解脂耶氏酵母超高通量篩選策略提供了有價(jià)值的指導(dǎo)。也展現(xiàn)出了天木生物ARTP+EVOL cell在適應(yīng)性進(jìn)化及非直觀目標(biāo)基因挖掘方向的強(qiáng)大潛能。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2024.131035
本期為您推薦天津科技大學(xué)路福平教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在《Bioresource Technology》上的一篇文章：Multidimensional combinatorial screening for high-level production of erythritol in Yarrowia lipolytica。
作者采用了一種多維度組合篩選策略，包括基于生長(zhǎng)耦合生物傳感器的適應(yīng)性進(jìn)化篩選平臺(tái)（EVOL cell）以及代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)快速篩選能夠高效利用粗甘油生產(chǎn)赤蘚糖醇的突變菌株，為生物基產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了新的思路和方法。
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作為一種被廣泛研究的宿主菌株，工程化改造后能夠?qū)⑸锊裼托袠I(yè)的副產(chǎn)品粗甘油酯轉(zhuǎn)化為赤蘚糖醇，實(shí)現(xiàn)其高值化利用，但其生產(chǎn)效率有待提高。因此，需對(duì)解脂耶氏酵母的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重構(gòu)，以實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化應(yīng)用。
然而，對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜調(diào)控細(xì)節(jié)的了解不足仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。研究者認(rèn)為需通過(guò)多維組合篩選不斷挖掘非直觀的目標(biāo)基因，而隨機(jī)誘變和適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化是提高宿主菌株代謝性能的有效方法，因此研究者構(gòu)建了一套包括生長(zhǎng)偶聯(lián)的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化和代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)在內(nèi)的多維組合篩選策略。
本研究利用基于Eryd轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和其DNA結(jié)合序列的生物傳感器，構(gòu)建了響應(yīng)赤蘚糖醇的熒光偶聯(lián)生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了解脂耶氏酵母中赤蘚糖醇水平的動(dòng)態(tài)檢測(cè)。
圖1 赤蘚糖醇生物傳感器的構(gòu)建和優(yōu)化
隨后將 LEU2 基因替代 DsRed 基因，以細(xì)胞生長(zhǎng)表型作為輸出信號(hào)，構(gòu)建了生長(zhǎng)偶聯(lián)的生物傳感器。利用ARTP誘變育種儀對(duì)含有生長(zhǎng)偶聯(lián)生物傳感器的解脂耶氏酵母進(jìn)行誘變，并通過(guò)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)菌株生長(zhǎng)條件的EVOL cell自動(dòng)連續(xù)培養(yǎng)篩選突變體，完成全自動(dòng)適應(yīng)性進(jìn)化。
EVOL cell是基于高氣體透過(guò)性微管路及單相微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)而成的微生物馴化裝備，具有環(huán)境氧分壓調(diào)控、溫度控制、化學(xué)因子梯度添加等多種適應(yīng)性進(jìn)化策略，可滿足不同實(shí)驗(yàn)需求，靈活調(diào)整壓力條件，全自動(dòng)進(jìn)行單因素或多因素實(shí)驗(yàn)。
突變株在EVOL cell中進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)48天的連續(xù)監(jiān)測(cè)和自動(dòng)連續(xù)培養(yǎng)，全程無(wú)需人工值守。經(jīng)過(guò)5個(gè)適應(yīng)階段的富集（篩選介質(zhì)中亮氨酸濃度從100 mM逐漸降低到0 mM），最終篩選出了14個(gè)具有大型菌落的突變菌株G02-15。在250 mL搖瓶發(fā)酵中評(píng)估這些突變菌株的赤蘚糖醇生產(chǎn)性能，結(jié)果顯示，G12菌株赤蘚糖醇滴度最高（62.4 g/L），是對(duì)照菌株G01的4.4倍。
隨后對(duì)G12進(jìn)行基因組測(cè)序及反向工程，發(fā)現(xiàn)SMF1、NADPH脫氫酶和ER1 D46A（M1）突變對(duì)赤蘚糖醇合成有積極影響。
圖2 開(kāi)發(fā)基于生長(zhǎng)偶聯(lián)生物傳感器和 EVOL cell篩選平臺(tái)
隨后進(jìn)一步對(duì)赤蘚糖醇生物合成的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重構(gòu)。先對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行分子修飾，通過(guò)迭代組合突變法，提高赤蘚糖醇還原酶 ER1 的催化活性。隨后敲除分解赤蘚糖醇的基因，過(guò)表達(dá)與甘油同化及前體供應(yīng)相關(guān)的基因，進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)。最終得到的菌株G31赤蘚糖醇滴度顯著提升了83.5 g/L。
圖3 ER基因的分子改造
圖4 工程菌株赤蘚糖醇生產(chǎn)性能的評(píng)價(jià)
最后于5L生物反應(yīng)器中，G31菌株的細(xì)胞密度和廢棄甘油消耗、赤蘚糖醇滴度、生產(chǎn)率和產(chǎn)率均高于G01菌株。其中G31菌株的赤蘚糖醇滴度達(dá)到了220.5 g/L，生產(chǎn)率為1.8 g/L/h，產(chǎn)率為0.6 g/g廢棄甘油。
本研究為基于生物傳感器的解脂耶氏酵母超高通量篩選策略提供了有價(jià)值的指導(dǎo)。也展現(xiàn)出了天木生物ARTP+EVOL cell在適應(yīng)性進(jìn)化及非直觀目標(biāo)基因挖掘方向的強(qiáng)大潛能。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2024.131035
