前言

       補料工藝的優化是發酵工藝優化最重要的研究方向之一，持續而又穩定的補料速率往往對最終產物的合成和菌株的代謝方向影響較大。多數產物的合成在補料過程中需要嚴格將培養基中的糖控制在一定濃度。傳統的控糖主要依靠操作人員不斷地取樣檢測與手動調節補料速度，時效性較差，調控效果也較差。發酵工程師們也始終在尋找著更穩定，更精確的控糖方式。本案例以色氨酸生產菌株E. coli TM01為出發菌株，采用賽多利斯（7 L）平行生物反應器，分別通過手動控糖和生物培養過程在線檢測儀（BODS）的自動檢測控糖策略兩種不同方式維持培養基中葡萄糖濃度，以色氨酸產量為指標來對比不同控糖模式的差異。

圖1 天木生物生物培養過程在線檢測儀（BODS）

實驗過程

       實驗菌種：E. coli WT01。

       種子液培養基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，葡萄糖20 g/L；

發酵液培養基：葡萄糖25 g/L，酵母提取物7 g/L，一水合檸檬酸1.1 g/L，硫酸銨7.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，三水合磷酸氫二鉀3 g/L，七水合硫酸鎂1 g/L，七水合硫酸鐵0.1 g/L，維生素B1 0.1g/L，甘油10 g/L，抗壞血酸 0.45 g/L，搖瓶發酵額外加入碳酸鈣5 g/L；

       發酵罐發酵培養：取甘油管中菌種活化后轉接至種子培養液37℃培養12 h后，按5%接種量轉接至發酵培養基。發酵過程在賽多利斯7L發酵罐中進行，通氣量為1vvm，通過溶氧關聯攪拌轉速將溶氧控制在30%，通過流加氨水將pH維持在6.9。37℃培養至OD600到10左右后，降溫至30℃并加入IPTG誘導。發酵過程中當培養基中的葡萄糖消耗完畢后，流加500 g/L的葡萄糖溶液將殘糖濃度控制在 2 g/L。

       手動補料組每1 h取樣檢測培養基中殘糖濃度，并根據所測濃度手動調整補料策略。自動補料組使用天木生物的生物培養過程在線檢測儀（BODS）實時檢測培養基中殘糖濃度，并由儀器自動調整補糖策略。發酵液中色氨酸濃度由液相進行檢測對比。

實驗結果

       如圖2所示，在手動補料模式下，由于無法實時觀察菌體的生長情況，培養基中殘糖濃度波動較大，而且由于夜間操作人員疲勞，誤差最大時甚至達到了+10 g/L的差異。殘糖濃度的波動直接影響了菌體的生物量和色氨酸產量，手動控糖組色氨酸產量最高時僅有約0.3 g/L。而與之相比，BODS的智能關聯補料完全摒棄了人為操作帶來的誤差，可以全天候實時監控發酵液中菌體的生長情況、檢測培養基中殘糖濃度（案例中設置為1 h自動取樣并檢測一次）并反饋給系統，然后根據設置值實時調整補料策略使糖穩定的維持在設定值（2±0.2g/L），更好的控糖策略也帶來了色氨酸產量的大幅度增加，與手動補料模式相比，BODS智能關聯補料模式下色氨酸產量提高了約71.4%。

圖2 手動補料和智能關聯補料發酵結果對比

結論

       本案例以產色氨酸工程菌株為出發菌株，研究了不同補料策略下對菌株色氨酸產量的影響。實驗結果證明：更穩定的控糖方式往往會帶來產量大幅度的增加。與手動補料模式相對比，BODS智能關聯系統在無操作人員的情況下通過自動取樣檢測、監控、反饋調節、自主學習補料策略等方式將培養基中殘糖水平穩定的控制在了設定值（2±0.2g/L），也使菌株的色氨酸產量提高約71.4%，這說明了BODS在發酵工藝優化中的重要作用。除此之外，在工業化生產中殘糖濃度的控制也是直接影響企業產品質量的關鍵參數，BODS的實時檢測能力也有助于生產車間人員實時掌控發酵過程變化，及時調整工藝參數，幫助企業更好的完成產物的放大生產。

       自成立伊始，天木生物恪守客戶至上的原則，致力于提供高度專業化的菌種優化方案，為發酵過程優化提供更多可靠選擇。